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细胞培养与显微镜
来源:东南科仪    发布时间:2021-02-22    阅读:27次
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哺乳动物细胞培养系统可以根据几种不同的特征进行细分。上一期我们介绍了其最显著的分类特征——形态,而另一个区别就是细胞类型。根据其来源,细胞可以细分为永生化细胞,原代细胞和干细胞(包括患者特异性细胞)。

 

细胞类型

永生化细胞

使用中最常见的细胞类型可以追溯到永生化细胞,这些细胞要么来源于肿瘤组织,要么已被癌基因转染。由于其恶性背景,它们会无限分裂。这以特性使它们非常适合作为细胞系进行培养,而且功能强大且价格适中。其他常用的永生化细胞系是HEKA549JurkatMDCKCOSVero细胞。

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原代细胞

原代细胞直接取自活体组织。为了培养,将原始组织片段通过酶、化学或机械方法解离为单个细胞,然后将其接种到培养瓶中。原代细胞比永生细胞系更难培养,他们的生存率很低,而且许多没有分裂。此外,它们的基因操作可能具有挑战性。尽管如此,还是值得付出努力的,因为它们的特性更接近自然细胞。换句话说,用原代细胞获得的实验结果可以更有信心地转化到体内。

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干细胞

干细胞是人体的原始细胞。它们可以从非专能细胞分化为具有专用特征和功能的专用组织细胞。因此,它们可以分为几类。多能干细胞(pluripotent stem cells)是用途最广泛的干细胞,能够分化为任何种类的人体细胞。与多能干细胞相比,专能干细胞(multipotent stem cells)显示出有限的分化范围。双能干细胞只能发育成两种不同的细胞类型。干细胞除了分化成特殊的细胞类型外,还可以自我更新。

 

 

细胞培养模式

上面提到的所有细胞类型都拥有不同的生长方式。例如,一次细胞培养可以仅由单个细胞类型或多种细胞类型组成,并且可以进行2D3D培养。

 

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另一方面,2D单培养也是维持细胞生长最人工的方式,主要原因有两个:细胞在生物体中呈3D生长,而且它们并不会与其他类型细胞分开生长。

 

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想要进入3D世界,细胞生物学家必须运用某些技巧。其中之一是消除细胞粘附在培养基上的机会,可以通过使用带有特殊涂层的细胞培养容器、使用凝胶培养基(例如Matrigel™),或通过悬滴培养细胞来实现。这种物体更接近更真实组织,包括天然组织中常见的代谢和增殖梯度。这也是球状体通常被用于药物开发的原因之一,因为它们精确地模拟了血管肿瘤。

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在更逼真的3D细胞培养的另一种方法是使用支架。可以利用由金属,聚合物或陶瓷制成的培养基来帮助细胞蠕变成三维形。这些支架可以用作临床植入,也可应用于实验室。

 

另一个非常真实的细胞培养组织是基于在细胞外基质凝胶内部存在不同生长因子的情况下培养的干细胞。根据生长因子的类型(egFGFEGF等)和其他组分,干细胞会发育成称为类器官的微型器官。

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生长条件

哺乳动物细胞培养必须保持在37°C,通常在具有各种形状和大小的专用一次性塑料容器中进行培养。

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其中最小的是96孔板,通常用于筛选应用。

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另一方面,有一些细胞工厂被用于大规模生产疫苗或蛋白质。

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与细胞培养物一起工作意味着在无菌条件下操作,例如在超净工作台上并使用抗生素。而且,必须向提供包含营养物和生长因子的适宜培养基,包括:葡萄糖、丙酮酸钠、氨基酸、维生素、无机盐、水、由于其不稳定性,因此经常添加氨基酸谷氨酰胺。蛋白质,脂质或生长因子通常添加在胎牛血清中补充。

 

细胞的代谢产物使培养基酸化。因此,缓冲液系统可用于维持pH稳定(〜7.4)。通常通过酚红指示剂监测pH,并使用碳酸氢盐(HCO3-)缓冲液,它们结合H+的能力取决于周围的CO2水平。因此,通常向细胞培养箱提供CO2HEPES缓冲液独立于CO2,通常用于无法进行CO2孵育的活细胞显微镜应用中。

 

显微镜

说到用于细胞培养的显微镜,其必须具备某些基本特征。哺乳动物细胞在液体培养基中培养就意味着显微镜必须具有倒置配置。在这种配置中,物镜安装在培养皿下方,培养皿放置在显微镜载物台上,聚光镜安装在上方。只有通过这种设置,物镜才能足够接近样品。此外,通过这种构造,研究人员在样品周围具有更多的自由空间。

 

想要大致了解细胞培养的总体状况,放大倍率为100x~200x足矣。哺乳动物细胞固有的低对比度要求显微镜提供特定的对比度方法。相差和调制相差是最常见的,而微分干涉(DIC)与通常用于细胞培养的塑料容器不兼容。

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借助这种基本设备,研究人员可以判断细胞数量和融合度。根据融合情况,将细胞传代培养至其他容器中。